|
Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из самых ярких событий конца прошлого столетия. Благодаря явным преимуществам он быстро получил широкое распространение в клинической практике. Среди нижегородских лечебных учреждений, внедривших этот метод, одним из первых стал Центр профилактики и борьбы со СПИД. В настоящее время его специалистами накоплен определенный опыт по этому вопросу, и поэтому не случайно, что именно здесь 15 февраля состоялась научно-практическая конференция на тему "Генодиагностика в инфектологии. Место ПЦР-анализа в комплексе лабораторных диагностических тестов". Для участия в ней в наш город приехали ведущие специалисты Научно-исследовательского института физико-химической медицины Министерства здравоохранения РФ (г. Москва).
Первый доклад нижегородской аудитории представил доктор биологических наук В. М. ГОВОРУН. Его тема "Молекулярно-биологические основы современных методов ДНК-диагностики. Проблемы интерпретации результатов лабораторных методов диагностики". В начале своего выступления докладчик подчеркнул, что методы ДНК-диагностики являются относительно новыми. Врачи должны понимать не только основные принципы этих методов, но и знать технологию проведения данных исследований. Эти знания позволят докторам правильно интерпретировать результаты анализов, полученных из лаборатории, а в конечном итоге правильно поставить диагноз заболевания.
Современные методы ДНК-диагностики относятся к прямым методам выявления возбудителей. Они обладают высокой чувствительностью и позволяют регистрировать единичные клетки бактерий и вирусов. Наиболее распространенным и наиболее известным является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Именно этому методу посвятил основную часть своего доклада В. М. Говорун.
Принцип действия ПЦР состоит в обнаружении специфической последовательности ДНК в биопробе путем умножения мишени. В его основе лежит репликация ДНК, при которой происходит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК. Это позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов, получить достаточное количество ДНК копий и идентифицировать их методом электрофореза. В настоящее время метод ПЦР применяется для диагностики инфекций и генетических заболеваний, а также для оценки эффективности проводимой терапии. Одной из наиболее перспективных сфер приложения метода докладчик назвал онкологию.
Основными этапами ПЦР-анализа являются:
- забор клинического материала;
- пробоподготовка;
- амплификация;
- регистрация результатов.
О каждом из этих этапов В. М. Говорун рассказал подробно, т.к. каждый из них влияет на результат анализа. Забор материала должен производиться стерильным одноразовым инструментом непосредственно из участка вероятной локализации микроорганизма. Объектом для ПЦР-диагностики могут быть любые биологические выделения организма, а также ткани, соскобы, архивные материалы. Правильная постановка преаналитического этапа, в том числе правильный забор проб, их хранение и транспортировка являются залогом успеха.
Следующим этапом является пробоподготовка, основной задачей которого является выделение ДНК из биопробы и удаление ингибиторов, препятствующих ПЦР. Старые методики представляли собой многоэтапные процедуры (до 15 манипуляций). При этом существовал довольно большой риск контаминации образца. В настоящее время разработан новый метод "ДНК-экспресс", при котором количество процедур сведено к минимуму.
Следующим этапом является амплификация, цель которой состоит в получении большого количества специфических фрагментов ДНК анализируемого микроорганизма (возбудителя). Специфичность метода обеспечивается за счет применения уникальных олигонуклетидных праймеров, узнающих только определенные участки ДНК, а чувствительность за счет многократно повторяющихся циклов амплификации.
| 
